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黑松苗如何抗松材线虫病

日期:2013-10-30 20:47 | 来源:未知 | 浏览:

水杨酸( salicylic acid, SA) , 又称邻羟基苯甲酸, 是广泛存在于植物体内的一种小分子酚类物质, 不仅参与植物的开花、种子发芽、气孔开闭、产热、膜的通透性及离子的吸收等许多生理生化过程, 而且还与植物的抗病性有关[ 1, 2] 。用SA 外源处理可诱导烟草、马铃薯、黄瓜等重要农作物产生对由真菌、细菌、病毒等引起的病害的局部和系统抗性[ 3] 。许多研究证实, SA 是诱导植物产生系统获得抗性( SAR)的信号分子; SA 外源处理可诱导多种植物积累病程相关蛋白( PRS) , 并诱发植物体内SA 的积累, 且内源SA 的积累先于SAR 基因的表达和抗病性表现。可见, SA 对信号传导和系统抗病性的表现是必不可少的, SA 积累平与抗病性密切相关[ 4] 。过氧化物酶( pero xidase, POD) 和苯丙氨酸解氨酶( Pheny-lalanine ammonia-lyase, PAL) 是广泛存在于植物体内的两种酶。大量的研究结果表明植株经诱导因子处理后, POD、PA L 的活性在诱导植株中明显增加, POD、PAL 酶活性被认为是植物的抗性指标之一。关于SA 对黑松抗松材线虫病的诱导作用, 目前国内外少见报道。笔者通过采用SA 对黑松幼苗进行叶面喷雾和浸根处理, 研究SA 对黑松幼苗抗松材线虫病的诱导抗性作用; 同时用SA 诱导处理6 月生黑松苗, 进一步研究了松材线虫病诱导抗性的生化机制。以期探讨SA 应用于黑松上是否产生对松材线虫病的诱导抗性以及松苗体内酶活性的变化状况, 为松材线虫病的可能防治途径提供参考依据。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
采用4、6 月龄黑松苗, 供试黑松种子源自山东。选取饱满黑松种子经浸泡、消毒后均匀撒在沙盆中, 定期浇水, 在温室中( 25 e , 光照16 h/ d) 生长4 个月和6 个月待用。水杨酸由西安化学试剂厂生产, 分析纯。将水杨酸用蒸馏水溶解, 用1 mo l/ L 的NaOH 将溶液pH调至中性, 配置成10 mmol/ L 的SA 母液, 试验时用蒸馏水稀释至所需浓度。供试松材线虫来自浙江马尾松。该虫株经先期致病力测定为强毒株系。将经培养扩繁的该虫株用贝尔曼漏斗法分离, 再用0. 1%的硫酸链霉素表面消毒3 min, 无菌水洗涤后采用人工皮接法挑战接种至预先经SA 诱导处理的4 月生黑松苗。
1. 2 SA 处理
设置4 种SA 浓度: 将浓度为0. 001, 0. 01, 0. 1, 1 mmo l/ L 的SA 分别喷洒至4 月生黑松上, 使植株全部针叶湿润, 同时设清水做对照, 喷雾后保湿24 h。处理5 d、10 d 后分别挑战接种松材线虫, 接种量分别为100, 200, 400 条/ 株。对照接无菌水。每处理6 个重复。设置6 种处理时间: 将4 月生黑松苗浸入0. 01 mmol/ L 的SA 溶液中, 分别浸泡处理10 min,30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h 后取出置于清水中, 并于5 d, 10 d 后分别挑战接种松材线虫, 接种量分别为100, 200, 400 条/ 株。对照接无菌水。每处理6 个重复。
1. 3 数据统计分析4 月生黑松挑战接种松材线虫后每天观测病情, 根据黑松幼苗的发病情况设定病株分级标准, 根据挑战接种4 d 后松苗的发病级值计算感病指数及诱抗效果。感病指数= E ( 各级病株数@ 该级代表数值)总株数@ 最高一级代表数值@ 100相对诱抗效果(%) = CK 感病指数- 处理感病指数CK 感病指数@ 100病株分级标准为0: 健康; 1: 少数针叶褐变; 2: 少数针叶褐变, 萎蔫下垂; 3: 半数针叶褐变萎蔫; 4: 全株萎蔫死亡。
1. 4 POD 和PAL 活性测定
将6 月生的黑松幼苗经0. 01 mmo l/ L 的SA 浸根处理3 h 后取出置于清水中, 每天进行取样, 5 d后采用人工皮接法挑战接种松材线虫, 接种量为200 条/ 株, 随后隔天取样。每种处理6 个重复。设清水为对照。黑松苗整株取样做分析样品, 每个样品设3 个重复。过氧化物酶( POD) 活性的测定参照李柏林、陈玉惠的方法[ 5, 6] ; 苯丙氨酸解氨酶( PAL) 活性的测定参照薛应龙、陈玉惠的方法[ 6, 7] ; 可溶性蛋白质含量的测定参照Bradfo rd 的方法, 即适量待测酶液按标) 50 )南京林业大学学报( 自然科学版) 第29 卷 第6 期准曲线制作方法进行操作, 并根据直线回归方程计算样品中可溶性蛋白质含量[ 8] 。
2 结果与分析
2. 1 SA 喷雾处理对黑松苗抗松材线虫病的诱导作用
用浓度为0. 001, 0. 01, 0. 1, 1 mmo l/ L 的SA 预先处理4 月生黑松苗, 并分别于处理5、1 0 d 后挑战接种松材线虫( 100, 200, 400 条/ 株) , 接种后4 d 松材线虫病的发病情况及诱抗效果见表1。不同浓度的SA 叶面喷雾处理对4 月生黑松苗抗松材线虫病都有一定的诱抗作用, 与CK 相比, 各处理的感病指数均较低。当SA 浓度为0. 01 mmol/ L 时其对黑松幼苗的诱抗能力较强, 诱抗效果可达61. 9% ; 而其他浓度诱导处理后, 诱抗效果均低于40% 。在供试浓度范围内, SA 未对黑松产生任何可见的毒害。
2. 2 SA 浸根处理对黑松苗抗松材线虫病的诱导作用
将4 月生黑松苗在0. 01 mmo l/ L 的SA 溶液中分别浸根处理不同时间, 5 d 及10 d 后分别挑战接种松材线虫( 100、200、400 条/ 株) , 接种后4 d 松材线虫病的发病情况及诱抗效果见表1。由表1 可见,SA 浸根处理不同时间诱导黑松苗抗松材线虫病的效果不同。试验中无论何种挑战接种量, 当浸根处理3 h 时, SA 的诱抗能力最强, 诱抗效果可达71. 4% ; 浸根处理10 min, SA 的诱抗能力次之, 诱抗效果为61. 9%。与对照相比, 各处理黑松苗的感病指数均较低。
表1 水杨酸处理对4 个月生黑松幼苗抗松材线虫病的诱导效果:
水杨酸处理对4 个月生黑松幼苗抗松材线虫病的诱导效果

 
2. 3 诱导间隔期对黑松苗诱抗效果的影响
无论是SA 叶面喷雾还是浸根处理, 经不同的诱导间隔期( 5 d, 10 d) 挑战接种松材线虫( 接种量为100, 200, 400 条/ 株) , 对4 个月生黑松苗抗松材线虫病都有一定的诱导作用( 图1)。诱导期为5 d 时,黑松苗对松材线虫病的诱抗效果要明显高于诱导期为10 d 时的诱抗效果。

 
2. 4 诱导处理方式对黑松苗诱抗效果的影响
诱导处理方式对黑松苗诱抗效果的影响图一与图二
SA 叶面喷雾和浸根两种处理方式对4 个月生黑松苗抗松材线虫病具有不同的诱抗效果( 表1) 。) 51 )2005 年 总第120 期 黎淑芬等: 水杨酸对黑松苗抗松材线虫病的诱导作用图1 不同诱导期对黑松苗抗松材线虫病诱抗效果的影响Fig. 1 Effect s of different induct ion period o n inducedr esist ance in Japanese black pine seedlings to pine wilt disease) u ) SA 喷雾5 d; ) t ) SA 喷雾10 d;) w ) SA 浸根5 d; ) v ) SA 浸根10 d与叶面喷雾相比, 当SA 浓度为0. 01 mmol/ L, 诱导间隔期5 d, 挑战接种量为200 条/ 株时, 浸根处理中黑松苗的诱抗效果较高。这可能与寄主植物对SA 吸收的量有关。由于针叶叶面窄小光滑, 喷雾处理可能不利于其对SA 的吸附和吸收, 而浸根处理则是通过根系吸收, 所以导致了两种处理方式诱抗效果的差异。2. 5 SA 诱导处理后黑松苗POD、PAL酶活性的变化用SA 诱导处理6 月生黑松幼苗, 在挑战接种前1~ 4 d, 与对照相比, 处理1 d 后POD 和PAL 酶活性就迅速上升, 且随后几天基本呈上升趋势, 第5 天挑战接种松材线虫, 与对照相比, SA 处理的松苗POD 和PAL酶活性继续上升, 8 d( 挑战接种后第3 天) 时活性达到最大值, POD 增加了146%, PAL 增加了64% , 随后酶活性开始下降, 12 d 时POD 仍高出对照221%, PAL 高出对照150% ( 图2) 。图2 SA 诱导后黑松苗POD 和PAL 活性的变化Fig . 2 Changes of pero xidase( POD) and phenylalanineammonia- lyase ( PAL ) act ivit y in Japaneseblack pine seedling s induced tr eatmentwit h SAp ) 水杨酸处理后的POD 活性; ) s ) 对照中的POD 活性;o ) 水杨酸处理后的PAL 活性; ) r ) 对照中的PAL 活性( POD 活性单位为湿重状态下的0. 1 A/ ( g # m in) ; PAL 活性单位为( ( A/ mg # h) )
 
3 讨 论
采用水杨酸叶面喷雾和浸根方式预先诱导处理4个月生黑松苗, 各处理对黑松苗抗松材线虫病都有一定的诱导作用。各处理病情发展较对照缓慢, 感病指数均低于对照。这表明SA 诱导4 个月生黑松苗产生了一定的对松材线虫病的抗性。SA 诱导处理后黑松苗体内POD、PAL 活性显著升高, 表明SA 处理诱导激发了松苗体内与抗病相关的酶活性。在不同的寄主植物及其病害系统中, 诱导植株产生抗病性的SA 浓度有所不同,同时也表明外源SA 的施用量与植物内源SA 的积累及其诱抗程度密切相关[ 2, 9~ 12] 。研究在SA 叶面喷雾的几种浓度试验中, SA 0. 01 mmo l/ L 时对松苗的诱抗效果较好, 表明诱导4 个月生黑松苗产生对松材线虫病的抗病性只需较低浓度的SA, 这一方面可能与供试黑松苗龄较小有关; 另一方面也可能与黑松苗内源SA 的含量有关。SA 不同的处理方式对植株产生诱导抗病性有一定影响[ 9, 10] 。笔者研究, 与叶面喷雾相比, 浸根处理的诱抗效果普遍要好。这可能因为松树针叶的特定结构和化学组成, 使其在SA 喷雾处理时对SA 的吸附及吸收能力较弱; 且松材线虫病属于维管系统病害, 而SA 作为诱导因子是可通过植物的维管系统在植物中运转的, 因此SA 浸根可较好地发挥其诱抗作用。诱导抗性的诱导期因诱导因子、植物和病害种类不同而不同[ 11] 。SA 处理诱发黄瓜叶片产生对霜霉病的诱导抗性需要1 d 的间隔期, 处理后3 d 表现出最大诱导抗性[ 10] 。而SA 诱发水稻抗瘟性的间隔期小于1 d, 处理后2 d 诱发的抗瘟性最强, 这种抗瘟性的持久期在15 d 以内[ 2] 。而用SA 浇土处理则不需要间隔期就可诱导烟草产生对AMV 和TRV 的系统抗性, 抗性的持久期在30 d 以上[ 12] 。这说明SA诱导处理后, 植物表现诱导抗性所需要的间隔期、最大诱导期以及持久期都因不同的植物病害系统而不同。试验中, SA 浸根处理的黑松幼苗在处理后5 d 挑战接种松材线虫产生的诱抗效果普遍高于处理后10 d 挑战接种的诱抗效果。而在SA 喷雾处理中, 除0. 01 mmol/ L 的SA 喷雾处理并于5 d 后挑战接种诱抗效果较好外, 其余处理总体来看差异较小, 诱抗效果普遍较低。SA 诱导松苗对松材线虫病产生诱抗的最佳诱导期、最大期及持久期仍有待进一步研究。植株的诱导抗病性还受到病原物接种量的影响。若病原物接种量较大, 诱导因子诱导植株产生的抗性不足以抵抗该病害, 则诱导的抗病性就不能很好地表现, 植株仍然会表现出发病的症状。相反, 病原物的接种量较小但又能致病时, 诱导因子诱导植株产生的抗病性可以抵抗该病害, 则诱导的抗病性能够得到很好的表现, 多次反复诱导甚至可以使植株在整个生长季节获得对该病害的完全抗病性。试验中, 松材线虫的挑战接种量对4 个月生黑松苗诱抗效果有一定的影响。无论是SA 浸根处理还是叶面
喷雾处理, 松材线虫挑战接种量为200 条/ 株时松苗的诱抗效果能得到较好的表现, 而其他处理( 松材线虫挑战接种量为100, 400 条/ 株) 诱抗效果不能得到较好的表现。这说明病原物的接种量、诱导因子和寄主植物诱抗的表现间存在相互关系。当然使黑松苗致病的松材线虫的最小接种量与达到最佳诱抗效果的松材线虫的挑战接种量是否一致以及关系如何还有待研究。吴岳轩报道用水稻白叶枯病弱毒菌株75-1 进行诱导处理, 能显著提高稻株叶片POD 活性[ 13] 。黄瓜幼苗经SA 诱导处理后, 与对照相比, POD 活性在24 h 后明显提高, 以后一直呈上升趋势, 至144 h 后较对照提高193% [ 14] 。国内外学者对病原物与植物互作时PAL 活性变化及其在植物诱导抗病性中的作用也进行了大量的研究, 普遍认为PAL 活性与植物诱导的抗病性成正相关。毕咏梅等用稻瘟病菌菌丝和培养滤液中提取的诱导物处理水稻幼苗和愈伤组织后PAL 活性提高[ 15] 。用无致病性的双核丝核菌( binucleate Rhi z octonia species BNR) 菌株232- CG 可以显著诱导防卫反应中的PAL 活性增加, 受BNR 诱导的抗病性与PA L 活性成正相关[ 16] 。此次试验也表明用SA 诱导处理黑松幼苗能够使其体内POD、PAL 活性显著提高, 且在用松材线虫挑战接种后, 酶活上升持续期长于对照。


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