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不同线虫在黑松体内的扩展速度与致病性

日期:2017-01-29 13:46 | 来源:未知 | 浏览:

摘 要:分别用强、弱致病力松材线虫和无致病力拟松材线虫接种 2 年生黑松苗。 观察结果表明:强致病力松材线虫在黑松体内扩散速度较快, 4 d 针叶开始发黄, 7d 松苗新梢开始萎蔫下垂, 10 d 松苗萎蔫, 线虫在松苗体内大量繁殖, 超过接种时的线虫数;弱致病力松材线虫在黑松体内扩散速度较慢, 7 d 针叶出现发黄的迹象,15 d 新梢开始萎蔫, 25 d 松苗整株萎蔫, 线虫数量开始增加, 超过接种时的线虫数;无致病力拟松材线虫接种后 7 d 仅在树梢分离到少量线虫, 梢部部分针叶发黄 , 之后线虫基本未繁殖, 25 d 松苗体内已分离不到线虫,梢部针叶症状未加剧, 松苗生长与对照类似。 因此, 黑松感染线虫后, 是否发病与线虫能否在松苗体内存活有关, 发病速度快慢与线虫在松苗体内扩散速度及能否大量繁殖有直接关系。
松材线虫(Bursaphelenchus x y lophilus)自 1905 年在日本九州的长崎县暴发后[ 1] , 在世界多个国家发生和流行并呈扩展蔓延趋势。松材线虫的致病力是影响其病害流行的重要因素 ,针对这个问题,已有一定的研究[ 2-9] 。但对于不同致病力松材线虫和拟松材线虫(B ursaphelenchus m ucronatu)在黑松 (P inus thunbergii )体内扩展速度及其致病力的关系尚未见报道 。为此笔者分别用强 、弱致病力松材线虫和无致病力的拟松材线虫共 3 种线虫接种 2 年生黑松幼苗,研究黑松幼苗在接种后的变化情况 ,掌握不同致病力线虫侵染松苗后线虫在松苗体内分布及松苗发病情况, 为研究松材线虫侵入黑松后的发病机理提供参考依据。
 
1、材料与方法:
1. 1、供试线虫和黑松:

     线虫虫株筛选:研究需要不同致病性的线虫虫株接种黑松苗 ,即从供试虫株中分别选取致病力最强的松材线虫 WY3(五月三),致病力较弱、发病程度较慢的弱致病力松材线虫 GQ2(宫崎 2)和无致病力的拟松材线虫 AN5 , 分别接种黑松。供试线虫用灰葡萄孢霉(Botry tis cinerea)玉米培养基培养。WY3和GQ2 来自日本,AN 5 来自安徽省。
     2 年生黑松苗来自江苏省连云港市容器苗, 2005 年 3 月 10 日移于室内栽培, 控制室温 25 ℃,湿度 80 %,40W 日光灯照明, 待室内适应生长 2 个月后 ,选取高度一致(平均苗高 12 cm)、生长良好的健康植株进行试验。

1. 2、接种测定:
1. 2. 1、线虫的接种接种时间为 2005 年 5 月 22 日。
     接种采用皮接法 :用锋利的刀片在黑松苗茎中部的一侧切开长约 0. 5 cm 的伤口, 伤口深达木质部,撕开韧皮部,在伤口处夹入一小团脱脂棉球, 用封口膜将黑松苗与脱脂棉包扎紧 ,封口膜外再用透明胶带包紧形成一个小漏斗, 将线虫悬浮液 0. 5 mL 滴入脱脂棉, 线虫接种量为 2 000 条/株 ,以蒸馏水为对照。为了保证线虫成活 ,在接种后的 24 h 内每隔3 h 给脱脂棉滴加适量蒸馏水保湿。接种后 ,室内温度保持 25 ~ 30 ℃, 观察黑松苗的变化, 定期取样, 观察线虫在寄主体内的扩散和繁殖情况, 分析不同致病力松材线虫在松树体内扩散速度与致病力。

1. 2. 2、接种后线虫数量的测定:
    3 种线虫接种松苗后, 依次在接种后 3 h 、6 h 、12 h 、1 d(24 h)、2 d 、4 d 、7 d 、10 d 、15 d 、25 d 取样 ,每次取 3 株重复 ,取样部位从接种点上、下 1 cm 处开始 ,每隔 0. 5 cm 取一长度为 0. 5 cm 的茎段进行线虫数量测定。取样时 ,将切好的茎段立即投入已装好 10 m L 蒸馏水的离心管中 ,静置过夜后取出茎段, 离心线虫并在显微镜下统计线虫数量。
 
1. 2. 3、接种后黑松苗横切面变化情况观察接种线虫后 ,将接种点向下 1. 5 cm 处的茎段的横切面用 OLYM PUS SZH 体式解剖镜观察 ,后用O LYM PUS C - 35 相机拍照, 时间分别选取接种后 1 、2 、4 、7 、10 、15 、25 d ,分别观察松苗接种线虫后横切面变化情况。
 
2、结果与分析:
2. 1、不同线虫接种后黑松的症状和线虫数量分布:

    在接种后按时取样并观察松苗的变化情况,取样时间和线虫分布数量见表 1(线虫数量为 3 株松苗中每 0. 5 cm 茎段线虫总量之和)。
     强致病力松材线虫 WY3 接入黑松苗后(表 1),3 h 内线虫基本未扩散 ,接种点上、下 1 cm 处未分离出线虫,6 h 有少量线虫在接种点上、下 1 cm 处分离出线虫, 2 d 时线虫扩散到树梢, 而此时黑松外观形态无明显变化, 到 4 d 时可观察到基部部分针叶开始褪绿变黄 ;7d 时幼苗当年生新梢开始萎蔫变褐 ,针叶失水变黄,切开松苗后可观察到木质部变色 ,此时整个黑松苗从树梢到根尖部位均可分离出线虫 ,但 
表 1  3 种不同致病力线虫接种黑松幼苗后线虫的分布与数量
 
Table 1 The distribution and number of nematode in Pinus thunbergii seedling after inoculated with three different pathoge-nicity nematode

  接种 接种线           松苗不同部位线虫分布数量*      
  取样时黑松症状     The distribution and num ber of nematode in different parts of pine seedling  
  时间 虫编号      
  Ch aractor 上 5 ~ 上 4 上 3 上 2 上 1 下1 下 2 下 3 下 4 下 5
  Time No.
      ~ 4. 5 ~ 3. 5 ~ 2. 5 ~ 1. 5 ~ 1.5 ~ 2. 5 ~ 3. 5 ~ 4. 5 ~ 5. 5
         
    W Y3 外观无异常   0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
  3 h GQ2 外观无异常   0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
    AN5 外观无异常   0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
                             
    W Y3 外观无异常   0 0 0 0 1 5 2 1 0 0
  6 h GQ2 外观无异常   0 0 0 0 3 3 0 0 0 0
    AN5 外观无异常   0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
                             
    W Y3 外观无异常   0 0 2 9 23 40 14 0 0 0
  12 h GQ2 外观无异常   0 0 0 2 7 10 4 0 0 0
    AN5 外观无异常   0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
                             
  1 d W Y3 外观无异常   0 0 5 7 9 28 17 35 15 0
  GQ2 外观无异常   0 0 2 0 0 2 0 0 0 0
(24 h)  
AN5 外观无异常   0 0 1 0 0 0 1 0 0 0
     
    W Y3 外观无异常   11 3 10 11 22 65 14 43 18 21
  2 d GQ2 外观无异常   0 0 0 1 0 1 1 8 0 0
    AN5 外观无异常   0 0 6 6 6 3 0 18 3 0
    W Y3 部分针叶褪绿变黄   13 27 5 16 53 44 49 34 14 16
  4 d GQ2 少数针叶发黄   0 4 2 1 0 6 6 2 4 0
    AN5 部分针叶叶尖发黄   0 0 2 1 2 1 0 6 3 0
                             
    W Y3 新梢萎蔫变黑、针叶失   22 34 45 161 153 27 55 104 245 77
  7 d   水变黄、木质部变色                      
  GQ2 发黄针叶数量增加   0 0 0 11 41 9 18 39 19 15
     
    AN5 梢部部分针叶开始发黄   1 2 1 3 6 10 3 3 0 0
                           
    W Y3 松苗萎蔫、针叶失水变黄、 86 51 10 15 157 590 627 302 60 23
      木质部变色加重                      
  10 d GQ2 发黄针叶从梢   4 1 3 92 10 26 47 63 32 39
    部向基部蔓延  
                           
    AN5 梢部部分针叶发黄   9 4 4 1 30 30 15 7 7 4
    W Y3 松苗整体干枯、针叶变黄、 1 0 12 8 1 86 114 230 61 56
      针叶与松苗易分离                      
  15 d GQ2 嫩梢开始萎蔫、   23 15 56 193 186 103 127 136 183 192
    基部针叶变黄  
                           
    AN5 梢部部分针叶发黄   0 0 0 1 1 1 1 0 0 0
                             
    W Y3 松苗枯死   0 0 0 2 2 1 0 6 1 0
  25 d GQ2 松苗萎蔫、针叶变黄   0 0 20 32 14 678 603 183 128 0
    AN5 梢部部分针叶发黄   0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
 
注:*表示线虫数量测定以黑松苗的上、下梢部每隔0. 5 cm 茎段的线虫数量。
 数量并不多;10 d 时松苗萎蔫、针叶失水变黄、木质部褐变加重, 此时线虫的数量大幅上升并达到最多,超过接种时的线虫数量。可以看出线虫在 7 ~ 10 d 的时段内快速大量繁殖。到 15 d 时黑松整体干枯、针叶变黄, 针叶与松苗极易分离 ,线虫的数量开始迅速减少 ;到 25 d 时松苗已彻底死亡 ,在松苗内只能分离到极少量的线虫 ,这可能是由于黑松体内严重缺水导致大部分线虫死亡。统计结果表明 ,线虫进入松苗后向下移动的速度要快于向上移动的, 如在 6 h 时 , 线虫向上只移动到 1 cm 处, 而向下已达到 3 cm , 同时向下移动的线虫数量也远远多于向上移动的线虫数量, 这与厉艳的观察结果一致[ 10] 。
     弱致病力松材线虫GQ2 接入黑松苗后(表 1), 3 h 在接种点上、下1 cm 处内未能分离出线虫, 6 h 可在接种点上、下 1 cm 处分离出少量线虫, 此后到 7 d 这一时间段内松苗中线虫数量保持较低水平。10 d 时线虫的数量开始增加, 到 15 d 时松苗内的线虫数已超过接种时的数量 ,25 d 时线虫数量大幅上升 ,说明线虫在 10 ~ 25 d 这段时期才大量繁殖。从外观形态观察 ,黑松在接种后到 4 d 时可观察到梢部少量针叶开始褪绿变黄;7d 时发黄针叶增多 ;10 d 时针叶黄化从梢部向基部蔓延,此时整个黑松从梢部到根尖处均可分离出线虫 ;到 15 d 时松苗嫩梢开始萎蔫、基部针叶变黄 ;到 25 d 时松苗萎蔫, 针叶变黄 ,此时线虫的数量达到最高峰。
     无致病力拟松材线虫 A N5 接入黑松苗后(表 1), 12 h 时在接种点上、下 1 cm 处未能分离出线虫,直到 24 h 时在接种点上、下 1 cm 处分离出极少量线虫, 7 d 时在树梢处分离出线虫 ,10 d 时黑松苗可在整株树中分离出线虫 ,15 d 时线虫分布范围缩小 ,只可在接种点上、下 3 cm 以内分离出线虫 ,到 25 d 时黑松苗体内已经分离不出线虫 ,说明接种的线虫已死亡。在整个过程中,从松苗内分离出来的线虫数量一直不多 ,说明线虫基本未能在松苗体内繁殖。这可能是黑松体内产生的物质不适宜或抑制了AN5 的生长。从外观形态观察, 黑松在接种 4 d 后可观察到树梢部位部分针叶叶尖开始变黄 ;7 d 时树梢部部分针叶开始发黄 ,此后一直到 25 d 时只是维持部分针叶发黄的症状,没有加剧。从接种伤口观察到 :接种后 15 d 左右伤口部位已经长出新的愈伤组织 ,表明接种部位基本恢复正常生长 ,而在强、弱致病力松材线虫接种黑松苗后 ,伤口处一直没有长出愈伤组织。

2. 2、不同线虫接种后黑松横切面变化:
    接种后按时取样并观察松苗接种线虫后横切面变化,取样时间和松苗截横切面变化情况见图 1 。
图 1  3 种不同致病力线虫接种黑松苗后接种点下 1. 5 cm 处不同时间段的横切面状况

图 1  3 种不同致病力线虫接种黑松苗后接种点下 1. 5 cm 处不同时间段的横切面状况
接种强致病力松材线虫 WY3 后(图 1A),通过体式解剖镜观察松苗接种点下 1. 5 cm 处不同时间段的横切面可以看出:松苗最早表现出的症状是髓部的变化,接种 2 d 后髓心开始变褐色, 出现小的空洞,随着时间的推移 ,髓心褐变加剧, 空洞有增大的趋势 ,特别是到 15 d 后, 髓心严重褐变 ,髓已经基本破坏,形成空腔,到 25 d 时髓部已完全被破坏。树脂道的变化, 2 d 时开始围绕树脂道周围的薄壁细胞开始变色 ,7 d 时就可发现树脂道分泌树脂明显减少, 10 d 时横切面基本没有树脂渗出 ,到 25 d 时树脂道已无树脂渗出。
     接种弱致病力松材线虫 GQ2 后(图 1B),通过观察松苗接种点下 1. 5 cm 处不同时间段的横切面可以看出 :黑松最早表现出的症状也是髓部的损伤, 在接种 4 d 后,可观察到髓心开始变褐色, 出现小的空洞,随着时间的推移 ,褐变加剧 ,髓心空洞有增大的趋势 , 到 25 d 后, 髓心已经大部分破坏, 形成空腔。树脂道的变化, 从 4 d 开始围绕树脂道周围的薄壁细胞开始变色,到 10 d 时就可发现树脂道分泌树脂明显减少,到 25 d 时切面基本没有树脂渗出 ,此时松苗的表现症状与接种强致病性松材线虫 W Y3 后 10 d 的症状相似。
    接种无致病力松材线虫 AN5 后(图 1C),通过观察黑松接种点下 1. 5 cm 处不同时间段的横切面可以看出:黑松髓部变化不明显 ,髓心基本未观察到空洞 ,随着时间的推移变化不大。树脂道的变化不明显,树脂道分泌树脂基本正常 ,没有明显的变色。
 
3、讨 论:
     通过对强、弱致病力松材线虫和无致病力拟松材线虫接种 2 年生黑松苗后线虫在松苗内扩散的观察,可以看出:(1)强致病力松材线虫进入黑松苗后 ,松材线虫比较适应松苗体内环境 ,线虫扩散速度快,虽然线虫在松苗内总量不多但已引起松苗萎蔫并停止分泌树脂 ,松苗发病的时间短 ,强致病力松材线虫在松苗发病后繁殖能力极强。(2)弱致病力松材线虫在松苗体内扩散速度明显比强致病力松材线虫慢,弱致病力松材线虫的适应能力弱于强致病力松材线虫 ,这可能是由于弱致病力松材线虫侵入松苗后,松苗产生一些应激反应或是松苗内的一些物质不适宜线虫生存,阻碍了线虫的快速繁殖。(3)无致病力的拟松材线虫接种松苗后, 松苗可能产生应激反应或是松苗自身的物质不适宜拟松材线虫生长 ,线虫在黑松体内扩散速度很慢 ,由于无致病力的拟松材线虫不能在黑松体内存活与繁殖, 也不会导致黑松死亡。这就表明松材线虫的致病力强弱、对黑松苗的危害程度与线虫的扩散速度、繁殖速度呈正相关, 若线虫无法在松树内存活并繁殖 ,则不会导致松树死亡。
     线虫接种松苗后 ,随着时间推移,线虫在松苗内不同部位的数量分布与线虫致病力强弱、接种线虫的数量和松树病程的变化密切相关。M amiya 研究认为:线虫侵入松树后在比较短的时间内,就在松树内广泛地移动, 在线虫数量增加的同时 ,松树生理上也出现了异常的变化[ 11] 。真宫靖治则认为:线虫在侵入松树后,向植株的枝、干和根各个部位移动,其数量逐步增多 ,当植株枯萎时 ,线虫的密度最大 ,这与本次实验的结果相似[ 12] 。
     在对 2 年生黑松接种不同致病力线虫的研究中发现:不论是接种强致病力或是弱致病力松材线虫,接种后松苗都会出现典型病害症状 ,导致松苗死亡,而接种无致病力拟松材线虫后 ,松苗并不死亡。这说明黑松苗是否发病与线虫在树体内繁殖、扩散速度有直接关系 ,致病力强的线虫扩散速度快、繁殖能力强 ,其导致黑松死亡的速度快;致病力弱的线虫扩散速度慢、繁殖能力弱 ,其导致黑松死亡的速度慢;无致病力的拟松材线虫在松苗体内扩散速度很慢 ,基本不能存活 ,不会引起松苗死亡。

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